HPLC操作指南 | HPLC Operation Guide

高效液相色谱仪的操作流程、理论基础和使用经验

高效液相色谱（HPLC）操作指南

High Performance Liquid Chromatography Operation Guide

📋 仪器简介 | Introduction

高效液相色谱法（HPLC）是将少量液体样品注入装有微小颗粒（直径为3至5μm，称为固定相）的管子中，样品中的单个成分随着通过泵输送的高压液体（流动相）通过色谱柱进入装有颗粒的管子。

High Performance Liquid Chromatography (HPLC) is a technique that injects small amounts of liquid samples into columns packed with tiny particles (3-5 μm diameter, called stationary phase), where individual components are separated as they travel through the column with high-pressure liquid (mobile phase) delivered by pumps.

🔬 基本原理 | Basic Principles

ℹ️ 分离原理
柱填料用于将成分相互分离。这涉及到其分子与填料颗粒之间的各种化学和/或物理相互作用。分离出来的成分会在色谱柱出口处被检测器检测到，检测器会测量这些成分的含量。

工作流程：

1

样品引入

将样品注入流动相中，开始分离过程
2

色谱分离

样品中各组分与固定相发生不同程度的相互作用，实现分离
3

检测分析

分离后的组分依次被检测器检测，生成色谱图

🔧 系统组成 | System Components

HPLC系统一般由输液泵、进样器、色谱柱、检测器、数据记录及处理装置等组成。其中输液泵、色谱柱、检测器是关键部件。

1. 输液泵系统

💡 泵的性能要求
输液泵的性能好坏直接影响到整个系统的质量和分析结果的可靠性。

性能要求：

  • 流量稳定：RSD应≤0.5%
  • 流量范围宽：分析型0.1~10mL/min，制备型可达100mL/min
  • 输出压力高：一般应达到150~300kg/cm²
  • 液缸容积小
  • 密封性能好，耐腐蚀

泵的类型：

往复式柱塞泵：

  • 单活塞往复泵
  • 双活塞往复泵
  • 特点：恒流泵，不受系统阻力变化影响

隔膜型往复泵：

  • 活塞不直接接触流动相
  • 死体积小（约0.1mL）
  • 更换流动相后平衡快

气动放大泵：

  • 恒压泵
  • 结构相对简单
  • 适用于特定应用

2. 进样器

HPLC进样器操作演示

3. 色谱柱

色谱柱规格分类：

柱类型内径柱长用途
常规分析柱2~5mm (常用4.6mm)10~30cm日常分析
窄径柱1~2mm10~20cm高分辨分析
毛细管柱0.2~0.5mm-微量分析
半制备柱>5mm-少量制备
制备柱20~40mm10~30cm大量制备

4. 检测器

检测器要求：

  • 灵敏度高
  • 噪音低
  • 线性范围宽
  • 重现性好
  • 适用范围广

🎥 操作视频教程 | Operation Videos

基础操作流程

HPLC基础操作流程演示

流动相配制

流动相配制和脱气处理

色谱柱安装

色谱柱正确安装方法

梯度洗脱设置

梯度洗脱程序设置

🔄 标准操作程序 | Standard Operating Procedure

开机准备

1

系统检查

  1. 检查电源连接
  2. 确认流动相储量
  3. 检查废液瓶容量
  4. 确认所有连接牢固
2

流动相准备

  1. 配制所需流动相
  2. 超声脱气10-15分钟
  3. 过滤（0.45μm滤膜）
  4. 将流动相置入储液瓶
3

系统启动

  1. 开启检测器，预热30分钟
  2. 启动泵系统，低流速冲洗管路
  3. 逐步提升至工作流速
  4. 观察基线稳定性

样品分析

4

样品准备

  1. 样品过滤或离心处理
  2. 适当稀释至检测范围
  3. 使用与流动相相容的溶剂
  4. 避免样品中有颗粒物质
5

方法设置

  1. 选择合适的色谱柱
  2. 设置流动相组成
  3. 确定流速和柱温
  4. 设置检测波长
  5. 设定进样体积
6

进样分析

  1. 使用进样针抽取样品
  2. 排除气泡
  3. 进样操作要快速准确
  4. 观察色谱图实时显示

关机程序

7

系统清洗

  1. 用纯水冲洗管路系统
  2. 如使用缓冲盐，需充分清洗
  3. 最后用甲醇或乙腈冲洗
  4. 关闭泵系统
8

设备关闭

  1. 关闭检测器
  2. 记录使用情况
  3. 整理工作台面
  4. 切断电源

💡 使用经验与技巧 | Tips & Tricks

流动相选择

💡 流动相优化
  • 反相色谱：常用甲醇-水、乙腈-水系统
  • 缓冲液：维持适当pH值，提高分离效果
  • 添加剂：三乙胺（减少拖尾）、甲酸（提高响应）

色谱柱维护

延长柱寿命的方法：

  1. 使用保护柱
  2. 样品预处理充分
  3. 避免pH极端值
  4. 定期再生处理
  5. 妥善储存

常见问题解决

基线噪音大：

  • 检查流动相是否充分脱气
  • 确认检测器灯源稳定
  • 检查管路连接是否漏液

峰形不好：

  • 优化流动相组成
  • 检查色谱柱性能
  • 调整样品浓度

保留时间漂移：

  • 确保流速稳定
  • 检查柱温控制
  • 流动相组成准确

📊 数据分析 | Data Analysis

定性分析

  • 保留时间比对
  • 光谱信息确认
  • 标准品对照

定量分析

  • 外标法
  • 内标法
  • 标准加入法

HPLC数据处理和分析方法

📚 参考资料 | References

推荐书籍

  1. 《现代液相色谱法》
  2. 《HPLC实用指南》
  3. 《液相色谱-质谱联用技术》

相关标准

  • GB/T 30431-2013 液相色谱仪
  • USP通则<621>液相色谱法
  • ICH Q2(R1)分析方法验证

⚠️ 安全注意事项 | Safety Precautions

🚨 安全警告
  1. 有机溶剂：在通风良好环境下使用，避免吸入蒸气
  2. 高压系统：注意管路连接，避免高压泄漏
  3. 废液处理：按规定收集处理有机废液
  4. 电气安全：保持设备干燥，定期检查电路

🔧 维护保养 | Maintenance

日常维护

  • 每日记录使用状况
  • 定期更换流动相
  • 保持设备清洁
  • 检查管路连接

定期保养

  • 更换密封圈
  • 清洗进样阀
  • 检定流量准确性
  • 校准检测器

📞 技术支持 | Technical Support

联系方式：

  • 实验室管理员：江韬
  • 邮箱：tjiang23@mail.ustc.edu.cn
  • 设备厂商技术支持热线
  • 在线技术文档

相关链接：